Хозяйства вынуждены тратить огромные средства на закупку различных химических средств защиты растений от вредителей и для борьбы с патогенами. При этом вносимые химикаты загрязняют окружающую среду, они оказывают вредное воздействие на млекопитающих и полезных насекомых. Поэтому поиск, а также создание с помощью генно-инженерных методов, устойчивых к вредителям новых растений - сейчас одна из актуальнейших задач.
Накопленные знания о механизмах патогенеза и современные возможности генетической инженерии позволяют разрабатывать научные методы создания ГМ растений, которые устойчивы к насекомым-вредителям, к грибным, бактериальным и вирусным инфекциям.
Давно известно, что бактерия Bacillus thuringiensis синтезирует белковые кристаллические структуры, обладающие сильным инсектицидным действием. Попадая в кишечник насекомых, белок расщепляется под действием протеаз насекомого до активного токсина, который и вызывает гибель насекомого.
Известно и уже изолировано много различных Bt генов (cry гены), кодирующих инсектицидные белки, которые очень специфичны для различных видов насекомых. Важно подчеркнуть, что эти белки совершенно не токсичны для млекопитающих, рыб, беспозвоночных и полезных насекомых. Естественные Bt гены, перенесенные в растения, плохо экспрессируются. Поэтому генно-инженерными методами их модифицируют, добиваясь более высокой экспрессии в клетках растений. Так, замена 4 участков гена cry III класса на синтетические фрагменты привела к резкому повышению экспрессии гена. Созданные трансгенные растения баклажана полностью устойчивы к колорадскому жуку.
Первый коммерческий сорт картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, создан фирмой Монсанто путем введения в геном картофеля модифицированного Bt гена cry III. Этой же и другими фирмами на основе Bt генов получены устойчивые к насекомым коммерческие сорта хлопка, кукурузы и риса.
Защита от насекомых может быть достигнута путем создания ГМ растений, несущих гены, кодирующие инсектопестициды грибов - пестициды. Например, из некоторых грибов выделены высоковирулентные изоляты против тлей и белокрылки – насекомых, наносящих огромный вред при выращивании растений в теплицах.
В качестве кандидатов генов, чьи продукты могут обладать инсектицидным действием, могут быть гены ингибиторов сериновой и цистеиновой протеаз, сr-амилазы, лектинов, хитиназ, липоксигеназ. Активно ведутся работы по клонированию генов и созданию ГМ растений, устойчивых против грибных, бактериальных и вирусных инфекций. Известно, что в ответ на инфекцию патогенов в растениях включается целый набор различных защитных механизмов.
Реакции растений на фитопатогены можно разделить на 3 группы:
· растение имеет полный иммунитет против данного патогена;
· в ответ на повреждение происходит быстрая программируемая гибель клеток в точке внедрения патогена (так называемая реакция сверхчувствительности), при этом патоген не успевает распространиться и погибает вместе с клетками растения;
· патоген преодолевает ответные защитные реакции организма и вызывает различной степени повреждения вплоть до гибели растения.
В качестве защитного ответа на повреждение в растении начинается синтез соединений, токсичных для патогенов, могут также создаваться структурные барьеры за счет усиления клеточных оболочек путем лигнификации или накопления гликопротеидов.
Инфекция вызывает у растений синтез вторичных метаболитов (например, антибиотиков типа фитоалексинов), окисление фенольных соединений, синтез защитных полипептидов (PR белки). Выделяют не¬сколько типов таких защитных белков: PR-1, PR-2 (бетта-1,3 глюканазы), PR-3 (хитиназы) PR-4, PR-5 (томатинподобные протеины) и PR-6 (ингибиторы протеаз).
У многих видов растений в ответ на атаку патогена возникает системно индуцированная устойчивость (SAR), главной реакцией при этом является синтез растением салициловой кислоты, которая связывает и ингибирует изозимы каталазы. Среди PR белков, связанных с грибной инфекцией, наиболее изучены хитиназы. Они гидролизуют хитин – основной компонент клеточной оболочки грибов. Созданные трансгенные растения табака с геном хитиназы фасоли под контролем 35S промотора успешно выживали в почве, зараженной патогенным грибом Rhizostonia solani.
Проведена агробактериальная трансформация сортов риса генами cht-2 и cht-З, кодирующими хитиназу риса под 35S промотором. Трансформанты характеризовались высокой устойчивостью к двум наиболее распространенным расам гриба Magnaporthe grisea, одного из самых вредоносных для риса патогенов. Наряду с хитиназой в конструкциях векторов широко используются (бетта-глюканазы для создания патогенустойчивых растений пшеницы, ячменя и др.
В последнее время обнаружен новый класс антимикробных пептидов, названных дефензинами. Дефензины выделены из семян многих видов однодольных и двудольных растений. Они состоят из 45-54 аминокислот и характеризуются значительным консерватизмом последовательностей нуклеотидов. Оказалось, что эти пептиды угнетают рост целого ряда грибов. Сейчас гены этих пептидов клонированы и используются для создания трансгенных растений. Трансформанты табака с геном дефензина редьки под 35S промотором характеризовались высокой устойчивостью против гриба Alternaria longipes. Разрабатывается также метод моделирования системы гиперчувствительности как защитной системы у растений с использованием генетических конструкций, содержащих ген бактериальной РНКазы (барназы) под контролем участка промотора картофельного гена prp I-I, обеспечивающего экспрессию гена в условиях грибного заражения. В случае инфекции индуцируется экспрессия гена и клетка погибает вместе с патогеном. Ведутся работы по поиску других подходов и систем для получения генетически модифицированных растений, способных противостоять грибным инфекциям.
Разработано несколько методов создания растений, устойчивых к вирусам растений. Один из них заключается в контролировании различных антисмысловых конструкций, где к ДНК-содержащая копия вирусной РНК помещается под промотор таким образом, чтобы в результате транскрипции образовалась последовательность РНК, комплементарная вирусной РНК. При заражении вирусом растительной клетки с такой конструкцией образуются дуплексы между вирусной и конститутивно синтезируемой антисмысловой РНК. Эти дуплексы разрушаются специфическими РНКазами, в результате чего вирусы не образуются и соответственно болезнь не развивается. Примером могут быть трансгенные растения табака, несущие антисмысловые конструкции для вируса мозаики огурца и вируса табачной мозаики.
Еще одним методом борьбы с вирусной инфекцией является клонирование и встраивание в геном растений гена синтеза белка оболочки вируса. Активный синтез такого белка, имеющего сродство с РНК вируса, ингибирует репликацию РНК вируса, что приводит к довольно высокой устойчивости растения. В этом случае наблюдается высокая специфичность реакции, т.е. защита достигается только против того вируса, ген белка которого был встроен в геном растения. Этот метод успешно использован для большого числа вирусов различных таксономических групп.
Созданы трансформанты риса с геном, кодирующим белок оболочки вируса Hoja bаnса.
Коммерческий сорт картофеля Бзура был трансформирован вектором, несущим ген оболочки вируса курчавости листьев в смысловой и антисмысловой ориентации. Полученные трансгенные растения проявляли высокую устойчивость к данному вирусу.
Возможную роль в защите растений от вирусной инфекции может играть внедрение генов защиты от вирусной инфекции, которые используются клетками млекопитающих. Так, введение гена бетта-интерферона или гена, кодирующего 2,5А-синтетазу, в клетки растений повышало устойчивость к вирусной инфекции. Разрабатываются подходы, в которых используются гены, кодирующие антивирусные белки растительного происхождения, гены, кодирующие специфические антитела, узнающие вирусные белки.
В последнее время появились работы, в которых приводятся данные о создании трансформантов против вироидов. В частности, получены трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген рибозима hammehead, транскрипты которого расщепляют минус цепь РНК веретеновидного вироида клубней картофеля.
Создаются также трансгенные растения, устойчивые к бактериальным болезням. При трансформации картофеля вектором, включающим 35S промотор, последовательности, кодирующие сигнальный пептид амилазы и гена лизоцима бактериофага Т4, у трансгенных растений отмечали повышение устойчивости к одному из главных бактериальных патогенов Ervinia caratovora, вызывающему мягкую гниль клубней «черную ножку».
Большой вред виноградникам наносит бактериальный рак, вызываемый Agrobacterium tumefaciens. Пораженные растения снижают качество и количество урожая. Иммунных сортов к бактериальному раку практически нет, а химические и биологические меры борьбы с ним не эффективны.
Однако установлено, что плазмиды IncW и IncQ агробактерий подавляют развитие рака. В вектор под 35S промотором был интегрирован ген ita, выделенный из плазмиды IncQ. Среди трансгенных растений табака и тополя выделены формы с высокой степенью устойчивости к агробактериальной инфекции.
